I. Introduction - Revue bibliographique

Le potentiel pathogène de Listéria et en particulier de l’espèce L. monocytogenes est dû à ses caractéristiques physiologiques et génomiques. Listeria à l’origine de la listériose, maladie mortelle pour 30% des cas, pose un réel problème de santé publique et pour les industries agro-alimentaires ‎[1]. Les différents programmes de recherche où s’inscrit l’unité de Génomique des Microorganismes Pathogènes ont pour objectif de mieux comprendre cette bactérie et la maladie qu’elle provoque et d’améliorer la prévention des contaminations notamment par le développement des puces de typage et d’analyse génomique « biodiversité Listéria ».

A. Présentation de Listeria monocytogenes

Listeria a été décrite pour la première fois dans les années 20, mais ce n'est que depuis la mise en évidence d'une origine alimentaire de la listériose humaine, lors d'une épidémie survenue au Canada en 1983, que cette maladie est reconnue comme un véritable problème de santé publique ‎[5]. Cela a conduit un certain nombre de pays à instaurer des systèmes de surveillance de l'infection, basée essentiellement sur la centralisation et la caractérisation des souches cliniques de L. monocytogenes dans un laboratoire [en France, il s'agit du Centre National de Référence des Listeria (CNR Listeria) localisé à l‘Institut Pasteur de Paris]. En France, la listériose est depuis mars 1998 une maladie à déclaration obligatoire ‎[1].

1. Caractéristiques et physiologie de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes est un bacille gram + à faible GC%, non sporulante, d’environ 0,4 μm de diamètre et de 0,5-2 µm de longueur, elle peut être présente sous forme isolée ou en petites chaînettes. ‎[1]

Ce germe pathogène est particulièrement résistant à des conditions difficiles de croissance. En effet, il s’agit d’un bacille psychrotrophe, il peut se développer à des températures de 1 à 45°C, ce qui lui permet de se multiplier dans les chambres froides. Il résiste aussi à la congélation. Cette faculté d’adaptation au froid est une caractéristique qui contribue à sa survie et sa multiplication dans les aliments, car il constitue un avantage par rapport aux autres bactéries lors de la conservation au froid. Il faut tout de même noter que le temps de génération de L. monocytogenes est plus faible à des températures de 4 à 8°C qu’à 30- 37°C. L. monocytogenes est uniquement mobile[1] à 20-25°C. ‎[1]

En plus de son adaptation au froid, la L. monocytogenes peut se développer dans des milieux riches en sels (elle est dite halophile), elle peut se multiplier dans des milieux pauvres en eau, et en oxygène puisqu’il s’agit d’une bactérie anaérobie facultative. Sa croissance est possible à des pH oscillants entre 6 et 9. Ces différents paramètres correspondent aussi aux caractéristiques des aliments sensibles à Listeria comme les fromages et la charcuterie. L'acidification du milieu permet de partiellement inactiver le germe, et de stresser les cellules survivantes, de sorte que la reprise de croissance est retardée.‎[1]

Cependant, même si ces bactéries paraissent très résistantes, une pasteurisation standard (30 min à 62°C) permet de les éliminer. Elles ne survivent pas à la plupart des désinfectants (les aldéhydes, les dérivés chlorés…).‎[1]

2. Taxonomie

Le genre Listeria comprend deux espèces pathogènes, L. monocytogenes et L. ivanovii (pathogène des ruminants), et quatre non pathogènes : L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri et L. grayi. Il existe 13 sérovars pour Listeria monocytogenes, mais ce sont majoritairement les types 4b, 1/2a et 1/2b qui provoquent la listériose (voir Tableau 1). Les souches du sérovars 4b semblent avoir un potentiel pathogène plus important car malgré le fait qu’elles sont rarement isolées dans la nourriture, on les trouve fréquemment responsable de cas de listérioses.‎[1]

3. Du point de vue génomique

Les chromosomes de listeria analysés à ce jour sont circulaires et d’une taille d’environ 3 000 000 paires de base avec un taux de G+C% de 37 à 39%. La souche de L. innocua qui a été séquencée contient aussi un plasmide de 81kbp. 2853 gènes codant pour des protéines ont été prédits dans le génome de la souche EGDe de L. monocytogenes. ‎[12]

Le génome de Listeria code pour un grand nombre de protéines des familles suivantes : des protéines de surface à motif LPXTG (voir Figure 1), des internalines, des systèmes de transport de sucres, des protéines similaires à des protéines de compétence de Bacillus subtilis et des régulateurs de la famille Crp/Fnr. La comparaison des séquences génomiques de L. monocytogenes et L. innocua est a été et est toujours utilisé pour identifier des gènes impliqués dans la virulence de L. monocytogenes et, plus généralement, à mieux comprendre la pathogénicité de L. monocytogenes et sa capacité à contaminer la nourriture ‎[12]. L. innocua est aussi retrouvé dans des aliments.

Figure 1 : Protéine de surface liés par covalence avec la paroi cellulaire contenant un motif LPxTG

Les deux génomes codent pour de nombreuses protéines de surface. Pour L. monocytogenes, 41 protéines contiennent un motif C-terminal Leu- Pro- X- Thr –Gly (LPXTG) qui permet d’avoir une liaison covalente avec le peptidoglycane (Figure 1). C’est à ce jour, la bactérie qui code pour le plus de protéines de cette famille. Parmi ces protéines, on retrouve les protéines de la famille des internalines (Inl). Les internalines InlA et InlB sont les mieux caractérisées. InlB présente un domaine de liaison non covalente à la paroi. Ces deux internalines sont notamment responsables du potentiel infectieux de L. monocytogenes en ayant un rôle essentiel dans l’entrée dans les cellules de l’hôte.‎[8]‎[12]

Le grand nombre de 331 gènes codant pour des transporteurs protéiques sont probablement impliqués dans la capacité de la colonisation et la croissance de Listeria dans un large panel d’écosystème ainsi que les protéines du système PTS (Système Phosphotranferase-Phosphoenolpyruvate dépendant) qui doivent permettre à Listeria d’utiliser une grande diversité de sucres. La proportion élevée de gènes régulateurs (Crp/Fnr ; GntR ; BglG) à hauteur de 7,3% peut expliquer la capacité d’adaptation à des environnements très divers de L. monocytogenes. ‎[12]

Quatre familles de protéines de stress ont pu êtres identifiés, leurs fonctions ont pu être établi dans les conditions de choc aux températures froides, mais également pour la résistance à l’acidification du milieu. Le génome de L. monocytogenes contient également des gènes de dégradation des sels biliaires. De manière intéressante, ces gènes sont absents chez L. innocua. ‎[12]

4. Epidémiologie

Listéria est à l’origine de la listériose. Infection essentiellement d'origine alimentaire, la listériose est diagnostiquée principalement dans les pays industrialisés. L. monocytogenes est un pathogène opportuniste. Les personnes à risques sont les sujets dont le système immunitaire est immature ou perturbé, c'est à dire, les femmes enceintes, les nouveau-nés, les personnes âgées et les patients immunodéprimés suite à une maladie ou à un traitement immunosuppresseur. ‎[1]

Cette infection se traduit par des formes invasives : bactériémie/septicémie et infection du système nerveux central chez le nouveau-né et l'adulte, et des avortements chez la femme enceinte. Le renforcement des procédures de surveillance et d’informations ont permis de diminuer l’incidence à moins de 4 cas par million d'habitants en France en l’an 2000. Néanmoins, la maladie est caractérisée par une mortalité élevée‎[21]. Plus récemment, des gastro-entérites à Listeria monocytogenes ont été décrites, mais, cette forme de listériose non invasive n'a pas été décrite en France à ce jour.‎[1]

En France, d'après le plan de surveillance de la Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répression des Fraudes réalisé au stade de la distribution, les aliments les plus fréquemment contaminés par Listeria monocytogenes sont les charcuteries cuites (langues, têtes, rillettes…), les produits de saucisserie, les graines germées réfrigérées, et certains produits laitiers (fromages à pâte molle et au lait crû).

À l'Institut Pasteur, le Centre National de Référence des Listeria est chargé de la surveillance microbiologique de la listériose humaine. Lors d'épidémies, il participe au dispositif associant la Direction Générale de la Santé, l'Institut de Veille Sanitaire, la Direction Générale de l'Alimentation et la Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répression des Fraudes.

La listériose évolue sous forme de cas sporadiques, auxquels peuvent s'ajouter des cas groupés voire des épidémies. Des cas de listériose sont dits groupés si au moins deux cas, dus à des souches non distinguables par une analyse en champs pulsé, surviennent dans un intervalle de temps inférieur à 6 mois, chez des personnes ayant fréquenté un même lieu d’exposition. Si l'intervalle de temps entre les cas est supérieur à 6 mois, on parlera de cas liés qui ont une importance épidémiologique moindre que les cas groupés. En France, en 2001, le CNR a recensé les souches de 185 cas sporadiques de listériose, soit le nombre le plus faible depuis 1987‎[21]. Ce nombre de cas est relativement stable depuis 1996. Avant cette date, le CNR a identifié jusqu'à environ 750 cas en 1992, dont 279 cas épidémiques liés à la consommation de langue de porc en gelée‎[17]. Le nombre de cas sporadiques a donc fortement diminué depuis 10 ans. Ceci résulte à une meilleure surveillance par les industriels et un control administratif en particulier.‎[1]

Du fait de la présence fréquente de L. monocytogenes dans l'environnement, il est très difficile d'empêcher toute contamination au niveau de la production des aliments. Afin d'améliorer la gestion de ces contaminations, les industriels sont intéressés par des méthodes de détection et de typage plus performantes et plus rapides ‎[1]‎[14].

B. Méthodes de typage

La caractérisation des souches de Listéria est très importante pour les investigations épidémiologiques. Elles permettent de mettre en évidence rapidement les cas groupés et les épidémies. Par ailleurs, elles sont aussi utilisées pour identifier l’origine alimentaire de cas de listériose. Par conséquent, de nombreuses méthodes de typages ont été décrites pour ce micro-organisme.

Le typage de Listéria monocytogenes a évolué en même temps que les progrès des techniques de biologie moléculaire. De la technique du sérotypage, la plus ancienne, suivirent la technique de lysotypage, le ribotypage puis l’électrophorèse en champs pulsé. Le but recherché est d’être de plus en plus discriminant en mettant à profit la biodiversité des Listeria. Ces méthodes permettent de classer les isolats et de définir des relations entre ces isolats. En particulier elles doivent permettre de dire si deux isolats ont la même origine et d'aider à l'identification de la source d'une épidémie ou de cas sporadiques.

1. Sérotypage

Les souches sont sérotypées en routine. C’est une technique facile à mettre en œuvre reposant sur le principe d’agglutination des bactéries sur sérums. Les combinaisons des facteurs antigéniques représentés dans le Tableau 1 définissent le sérotype. Deux types d’antigènes sont reconnus par ces sérums : les antigènes flagellaires et les antigènes somatiques (sans doute les acides teichoïques).

A ce jour, les déterminants génétiques de ces sérotypes sont encore largement inconnus. Les cas cliniques ont souvent été associés aux L. monocytogenes des sérotypes 4b, 1/2a et 1/2b. Cependant au-delà de l’aspect taxonomique de la technique, le sérotypage a une valeur épidémiologique limitée au vu de la biodiversité des listéria au sein d’un même sérovars. C’est donc dans ce but que d’autres techniques plus discriminantes ont été développées.

Tableau 1: Sérotypes au sein du genre Listeria

Espèce	Désignation	Antigène O (somatique)	Antigène H (flagellaire)
L. monocytogenes	1/2a	I ; II ; III	A ; B
	1/2b		A ; B ;C
	1/2c		B ; D
	3a	II ;III ;IV	A, B
	3b	II ;III ;IV	A, B, C
	3c	II ; III ;IV ; XII ; XIII	B, D
	4a	III ; V ; VII ;IX	A ; B ; C
	4b	III, V, VII, IX
	4c	III ; V ; VII
	4d	III ; V ; VII
	4e	III ; V ; VI ; VIII ;IX
	7	III ; XII, XIII
L. ivanovii	5	III ; V ; VI ; VIII ; X
L. innocua	6a	III ; V ; VI ; VII ;IX ;X ;XI
L. innocua	6b	III ; XIV
L. grayi			E

2. Lysotypage

La lysotypie est une technique qui n’est plus utilisée pour caractériser le genre Listeria du fait de problèmes d’interprétation, de reproductibilité et de discrimination. Le principe de la lysotypie repose sur la sensibilité aux phages. Une bactérie peut être résistante aux phages soit parce qu’elle est déjà lysogène soit parce qu’elle n’a pas de récepteur pour ce phage. Ceci est dû à la présence de différents types d’acide téichoïque entre les différents sérovars qui influent sur la sensibilité aux bactériophages. Par exemple, les phages A118 et PSA sont respectivement et spécifiquement infectieux pour les sérovars du groupe 1/2 et 4‎[19]‎[29].

3. Ribotypie

La ribotypie est couramment utilisée. Se basant sur la restriction de l’ADN total et l’hybridation à l’aide d’une sonde correspondant aux sous unités ribosomales 16s ou 23S, la ribotypie permet de mettre en évidence le polymorphisme des souches ‎[11]. Cette technique peut être facilement standardisée grâce à son automatisation par le riboprinter® ‎[27]. Cependant, le pouvoir discriminatoire de la technique est faible, notamment au niveau des souches de sérotype 4b. De plus, la ribotypie ne donne aucune information génomique ou fonctionnelle sur la souche et son coût est élevé.

4. Électrophorèse en champs pulsé (PFGE)

A ce jour la PFGE[2] est la technique la plus discriminante pour typer les souches de L. monocytogenes et est utilisée en routine dans la plupart des laboratoires dans le monde dont le CNR Listéria à l’Institut Pasteur. Elle permet, au niveau des industries agroalimentaires, une bonne traçabilité des souches environnantes, en connaissant leur pulsotype unique, et évaluer la maîtrise de qualité hygiénique lors de la désinfection des locaux. Une standardisation très poussée de la méthode a été nécessaire pour l’échange des données entre laboratoire. Le CDC (Control Disease Center) d’Atlanta a construit une banque de données « PulseNet » qui regroupe tous les profils de restriction obtenu par PFGE‎[18]. Chaque profil obtenu est répertorié par l’intermédiaire d’un code et chaque nouveau profil est comparé à cette banque en constante évolution. Celle-ci permet alors de tracer rapidement l’évolution des clones déjà isolés et de mettre en évidence l’émergence de nouvelle lignée. ‎[10]

Cependant la PFGE peut apparaître comme trop discriminatoire et biaiser les conclusions en différenciant une souche clinique d’une souche environnementale qui peuvent être séparées a posteriori par la présence ou non d’un prophage intégré. De plus, les profils de restriction obtenus ne donnent pas de renseignement sur les gènes présents si cette technique n’est pas complétée par une analyse par Southern blot.

5. Le typage par séquençage de sites multiples (MLST)

Le MLST (Multilocus sequence typing) repose sur le séquençage de plusieurs gènes, en général sept, conservés au sein d’une espèce. L’avantage de cette technique est la possibilité de comparer les résultats entre différents laboratoires et de donner des relations phylogénétiques entre les souches. Dans le cas de listeria, cette méthode est moins discriminante que l'analyse en champs pulsé ‎[26]. Par ailleurs le MLST est assez cher et lourd à mettre en place et ne peut être réalisé que dans des laboratoires équipés pour le séquençage.

Figure 2 : Représentation des différentes lignées à partir d’un PFGE numérisé de 62 souches représentatives de L. monocytogenes ‎[2]

La Figure 2 montre les deux principales divisions génomiques de L. monocytogenes identifié par la similitude des profils obtenu par PFGE. Il faut noter la corrélation entre les sérovars et ces différentes lignées définies sur la base de la structure du génome.

C. Les puces à ADN pour le typage de L. monocytogenes

1. Contexte du développement de ces puces

La connaissance complète des génomes bactériens a permis le développement d'un grand nombre de méthode d'analyse dite post-génomique. Parmi ces approches globales, les puces à ADN permettent d'analyser en une seule étape un grand nombre d'acides nucléiques. L'application principale concerne l'analyse des ARN messagers d'une cellule: le transcriptome. Les puces à ADN permettent aussi de détecter la présence ou l'absence d'un gène et donc de caractériser les différences de contenu génétique entre deux isolats d'une même espèce. Les puces « biodiversité » Listeria développées au laboratoire portent des sondes correspondant à des gènes spécifiquement présents dans différents isolats de Listeria, mais qui ne sont pas présents dans tous les isolats séquencés à ce jour. Elles sont établies à partir de la comparaison des séquences de plusieurs génomes.

Par une seule expérience d'hybridation, ces puces permettent d'établir une empreinte digitale correspondant aux gènes présents ou absents dans un clone, et constitue donc une méthode globale de typage. A la différence des autres méthodes de typage utilisées pour Listeria, les puces à ADN apportent une information fonctionnelle sur la nature des gènes qui différencient deux isolats. Ces résultats peuvent être comparés aux données phénotypiques sur les souches, notamment en relation avec leur virulence‎[13].

Après avoir séquencé les génomes de L. monocytogenes EGDe et L. innocua, l'unité GMP a développé une puce de typage pour L. monocytogenes dans le cadre de plusieurs consortiums. Les objectifs étaient de développer un outil de typage aussi résolutif que le champ pulsé et qui soit automatisable. Par ailleurs, dans le cadre de la comparaison d'un grand nombre de souches d'origine clinique ou environnementale, d'identifier les différences entre les souches et de définir s'il est possible d'identifier des caractéristiques spécifiques aux souches responsables de maladies chez l'homme. Ces études doivent permettre de comprendre l'évolution au sein du genre Listeria, de caractériser les transferts génétiques et d'identifier de nouveaux gènes de virulence. Par ailleurs à plus long terme la possibilité de prédire par une analyse génomique le risque associé à une contamination peut avoir une influence sur la gestion de cette contamination.‎[7]

Afin de réaliser ce projet l'Unité GMP s'est associée à différents partenaires ayant des expertises complémentaires sur la biologie des listéria, sur l'épidémiologie et sur les problématiques spécifiques aux industries agro-alimentaires dans le cadre de deux projets de collaboration, l’un interne à l’Institut Pasteur (le programme transversal de recherche), l’autre financé par le ministère de l’agriculture (le programme AQS).

a) Le programme transversal de recherche

La mise au point d’une puce de biodiversité Listeria a commencé au cours d’un programme transversal de recherche de l’Institut Pasteur mettant en jeu la collaboration entre trois laboratoires. Les objectifs sont :

Ø Le développement d'une stratégie pour l'analyse génomique d'un grand nombre de souches de Listeria en commençant par des souches de la collection de l'Institut Pasteur, afin d’établir une corrélation entre les données épidémiologiques et phénotypiques déjà collectées et les données génomiques récentes (l’épidémiologie génomique).

Ø L'identification de gènes et/ou de régions chromosomiques, potentiellement impliqués dans la pathogénicité et la compréhension de leurs fonctions. En particulier, la découverte, à l'aide de l'épidémiologie génomique, de gènes importants pour l'infection chez l'homme qui ne sont pas révélés par les modèles animaux actuellement disponibles.

Ø Le développement d'outils rationnels d'identification et de typage des isolats de L. monocytogenes. Ces outils devraient permettre de distinguer des contaminations potentiellement dangereuses de celles certainement sans risque.

b) Le programme AQS

Un deuxième programme d’étude de Listeria s’inscrit dans le cadre du programme Aliment – Qualité – Sécurité (AQS), financé par le Ministère de l’Agriculture de l’Alimentation de la Pêche et des Affaires Rurales, où l’unité de génomique des microorganismes pathogènes répond aux problématiques d’étude de la biodiversité de Listeria par une corrélation des techniques de biologie moléculaire et l’étude de la virulence.

Afin de mieux caractériser le risque dans un contexte de risque sanitaire lié aux aliments, l’unité GMP coordonne le programme qui vise en réalisant une étude d’un ensemble de souches représentatifs des divers habitats de L. monocytogenes (souches environnementales, d'aliments, de portage asymptomatique, des cas cliniques) de façon à préciser leur potentialité de virulence ou à l’inverse leur non pathogénicité.

Cette étude combine alors génomique, informatique, protéomique, transcriptomique et l’étude de la virulence pour pouvoir mieux caractériser les gènes responsables du potentiel pathogène de L. monocytogenes et ainsi pouvoir prédire et hiérarchiser les risques liés à des produits alimentaires contaminés.

Le programme d’étude AQS des Listeria s’effectue en collaboration avec les partenaires suivants :

Ø Unité des Interactions Bactéries-Cellules de l’Institut Pasteur (P. COSSART)

Ø Laboratoire des Listeria (P.MARTIN, M.DOUMITH)

Ø Laboratoire de Microbiologie UMR INRA Dijon (J.GUZZO).

Ø SRV-Microbiologie INRA de Theix (M.HEBRAUD).

Ø Laboratoire départemental de la Côte d’Or

Ø Industries agroalimentaires (Arilait, Entremont, Salaison Dijonnaise, Soredab)

La collaboration de l’ensemble de ces partenaires permet l’association de compétences multidisciplinaires pour répondre aux objectifs fixés. C’est dans le cadre de ce projet que s’inscrit mon stage de maîtrise.

2. Principe des puces à ADN

Les puces à ADN repose sur le principe d’hybridation moléculaire entre deux acides nucléiques simples brins. Cette hybridation moléculaire s’effectue lorsque deux brins sont complémentaires. Les quelques centaines de séquences d’ADN recherchées sont déposées sur un support. Cet ensemble constitue la puce à ADN. L’ADN à analyser va s’hybrider selon le principe d’hybridation moléculaire sur les différents acides nucléiques que porte constitue la puce à ADN. La détection de ces hybridations, après le lavage de l’ADN hybridé de manière non spécifique, s’effectue soit par détection de la fluorescence soit de la radioactivité (voir Figure 3).‎[13]

Figure 3 : Analyse d’acides nucléiques par puce à ADN.‎[13]

Ce principe peut être alors utilisé pour l’analyse de transcriptome en hybridant les ADN complémentaires des ARNm et également pour montrer l’absence ou la présence de gènes dans un génome par marquage de l’ADN génomique.

3. Analyse génomique : présence ou absence de gène

Au niveau d’une espèce bactérienne, l’analyse des génomes montre une grande diversité en contenu génétique. Une partie du génome étant partagé par tous les isolats et le reste étant spécifique de certains isolats. Par exemple 30% du génome de la souche d'E. coli O157:H7 sont absents de la souche commensale K12, Ces régions spécifiques d'une espèce peuvent correspondre à des éléments mobiles, des transposons, des prophages ou des plasmides ou des gènes indépendants de ces éléments. Cela peut correspondre à un seul gène, à un opéron ou à des régions plus complexes. Les puces à ADN permettent de détecter dans un génome la présence d'un gène pour lequel une sonde est portée par la puce. Le pouvoir de discrimination et de caractérisation génomique dépend donc des connaissances génomiques sur une espèce. La connaissance des génomes de plusieurs isolats représentatifs de la diversité de l'espèce permet d'améliorer la valeur de ce typage.

4. Conception de la puce biodiversité Listéria

L'unité GMP a développé deux générations de puce "biodiversité" pour listéria. Le développement de ces puces demande dans un premier temps la connaissance de la séquence des génomes de souches d’espèces de Listeria différentes et de sérovars différents puis d’une étude comparative génomique afin d’identifier les gènes suffisants et nécessaires pour permettre de discriminer les souches de listéria.

a) Séquençage et comparaison génomique

La première séquence génomique de L. monocytogenes (souche EGDe) a été publiée en la comparant à celle de l'espèce la plus proche non pathogène L. innocua. En excluant les gènes de prophage, 270 gènes sont spécifiques de L. monocytogenes et 149 gènes sont spécifiques de L. innocua (CLIP11626)‎[3]. Les 270 gènes spécifiques de L. monocytogenes sont regroupés en 100 îlots répartis sur le génome. L'évolution entre les deux souches correspond donc à un très grand nombre d'événements d'insertion ou de délétion. Ces deux espèces étant très proches phylogénétiquement, ces gènes constituent potentiellement de bonnes sondes pour le typage en relation avec la virulence. EGDe est une souche historique isolée de cobaye qui a été repiquée et distribuée dans de très nombreux laboratoires. La souche EGDe de sérovar 1/2a est un isolat particulier dont le génome a été séquencé et qui est devenue une souche de référence. ‎[12]

Afin de caractériser des souches d'origine humaine et de comprendre la virulence des Listeria pathogènes, il était important de connaître la séquence génomique d’une souche clinique‎[15]. L'unité GMP a ensuite déterminé la séquence génomique d'une souche épidémique de L. monocytogenes de sérovar 4b (CLIP80459). Cette souche a été isolée lors d’une épidémie qui a eu lieu en France à la fin de l’année 1999. Par ailleurs, les souches de sérovar 4b et celles de sérovar 1/2a représentent les deux sous-groupes principaux de l'espèce (Voir Figure 2). La connaissance de ces deux génomes permet donc de mieux couvrir la diversité de l'espèce, cette séquence génomique a été comparée avec celle de EGDe ‎[16]. La comparaison de ces deux génomes a mis en évidence une diversité du contenu génétique au sein même de l'espèce L. monocytogenes. En effet, environ 6% des gènes sont spécifiques d'une souche par rapport à l'autre. Afin d'avoir une connaissance génomique approfondie du genre Listeria, en collaboration avec le consortium allemand " Pathogenomics " l’unité GMP a déterminé aussi les séquences des génomes de L. ivanovii, L. grayi. L. seeligeri et L. welshimeri. Finalement, aux Etats-Unis, TIGR[3] (The Institute of Genomic Research) a séquencé le génome de deux souches sérovar 4b et d'une souche de sérovar 1/2a. L'ensemble de ces informations génomiques constitue une base de connaissance très riche pour la mise au point de puces biodiversité.

b) Les premières générations de puces à ADN

Une première puce de biodiversité de Listeria a été construite par l'Unité GMP sur la base de la comparaison des génomes de EGDe, L. innocua et de la séquence partielle de L. monocytogenes 4b CLIP80459. Cette puce porte 409 sondes, 262 correspondant à des gènes de la souche EGDe, 94 à la souche de L. innocua et 53 à la souche 4b. Cette première membrane a été utilisée pour une étude comparative génomique de 113 souches de Listeria ‎[7]. Les résultats d’hybridations avec cette puce de première génération ont permis de montrer qu'elle constituait un outil de typage performant permettant l'identification de l'espèce, le sérovar et permettant de sous grouper chaque sérovar. La présence des gènes de virulence connus a permis de montrer que les facteurs de virulence sont présents chez toutes les souches de L. monocytogenes testées.‎[7].

Une puce de 2ème génération a ensuite été construite en tenant compte d’autres séquences spécifiques d’une souche L. monocytogenes du sérovars 1/2b après le séquençage partiel d'une souche de ce sérovar et du sérovar 4b après l'achèvement de la séquence de la souche CLIP80459 et la publication d’une souche du sérovars 4b, séquencée par TIGR. Plus complète et plus représentative de l’espèce L. monocytogenes, cette puce a permis de confirmer les résultats obtenus avec la première puce (cf. ‎I.C.4.c)).

c) Résultats obtenus avec la puce de seconde génération.

En collaboration avec le Centre National de Référence des Listeria (Institut Pasteur), la diversité de l'espèce L. monocytogenes et la spécificité des souches d'origine clinique a été étudiée, par hybridation de la puce de 2ème génération portant 739 gènes spécifiques d'au moins une des souches séquencées (EGDe, 4b, L. innocua, 1/2b) ‎[7]. Les résultats d'hybridation obtenus pour 263 souches de L. monocytogenes, d'origine et de caractéristiques différentes, et pour 20 souches représentant toutes les espèces du genre Listeria montrent que ces puces sont un outil de typage puissant permettant de différencier les espèces du genre Listeria et de subdiviser les souches appartenant à l'espèce L. monocytogenes.

L'analyse génomique utilisant les puces à ADN « biodiversité Listeria », montre qu’il existe trois grands groupes chez L. monocytogenes en corrélation avec le sérovar : les souches de sérovars 4b, 1/2a et 1/2b :

Ø Les souches 1/2a clustérisent en deux grands groupes comprenant en majorité de souches d’origine environnementale et un autre sous groupe de souches de portage.

Ø Les Souches 4b (cette analyse est réalisée en ajoutant les données obtenues sur les souches analysées dans le cadre du programme AQS 23) se divisent en 4 grands groupes avec la présence de souches des différentes origines (épidémiques, environnementales, filière porcine et portage) dans chacun des grands groupes. Cependant les différents types de souches (épidémiques, environnementale, filière porcine et portage) peuvent se regrouper sous forme de sous groupe.

d) Difficultés rencontrés

Les groupements de souches obtenues par classification hiérarchique effectué à partir des données acquises par l’intermédiaire des puces à ADN correspondent exactement à ceux obtenu par PFGE. Cependant, la classification hiérarchique nécessite une binarisation du signal obtenu par les puces à ADN. Cette observation conforte la valeur de la classification des souches après typage par puce à ADN. Néanmoins, pour les souches proches l'existence de valeurs proches du seuil de binarisation donc ambigu entraîne des difficultés d’analyse. Deux souches identiques peuvent par exemple apparaître différentes par cette analyse.

D. Puce biodiversité de 3^ème génération

L'objectif de mon stage était la réalisation et la validation d'une puce de troisième génération avec comme cahier des charges de réduire le nombre de sondes en éliminant les sondes qui apportaient peu d'information et les sondes donnant des signaux ambigus et d'augmenter la valeur de discrimination de la puce par l'ajout de nouvelles sondes sur la base de l'ensemble des séquences disponibles. Ce projet a été réalisé en tenant compte de l'expérience acquise sur les deux premières puces.

1. Analyse et utilisation d’une puce à ADN pour le typage génomique

Afin de comprendre quels seront les enjeux du développement d’une nouvelle puce à ADN, il faut en rappeler les principes d’analyses et d’utilisations. C’est à partir du ciblage des difficultés qui peuvent survenir dans l’analyse des puces à ADN que des améliorations pourront être apportées.

Par l’intermédiaire du marquage, radioactif par exemple, lors de l’hybridation sur la puce un signal peut être détecté et quantifier (Voir Figure 4). Celui-ci sera ensuite normalisé et comparé à une valeur de référence pour quantifier l’ADN ayant hybridé à la sonde fixée. Afin de prédire l’absence ou la présence de gène au sein de l’ADNg analysé, il est nécessaire d’effectuer un traitement du signal. La définition d’un seuil de coupure va permettre de binariser (1= présence du gène, 0= absence du gène) l’information.

a) Quantification du signal

Dans le cas des puces de biodiversité, les puces sont de type macro-array avec un dépôt des sondes sur une membrane de nylon et un marquage radioactif de l’ADN. La quantification du signal est réalisée par activation d’écran phosphore et la lecture par le Typhoon (appareil de type phosphorimager). Le logiciel Array-vision est utilisé pour quantifier l’intensité de chaque dépôt.

Dans le programme Array-vision®, différents paramètres comme la distance entre 2 taches[4], le diamètre des taches, le nombre de colonnes, le nombre de lignes sont définis afin que le logiciel puisse créer une grille d’analyse qui sera placée sur l’image scanné de la membrane.

Figure 4 : Scan de la membrane portant 739 sondes en duplicata hybridée par l’ADNg de L. monocytogenes marquée radioactivement au ³³P

Figure 5 : Quantification des signaux avec Array-vision

Ce protocole est importé à partir d’une grille établie sous Excel comportant les noms de l’ensemble des sondes déposéesspottées sur la membrane, pour pouvoir faire la liaison entre les taches et les noms de gènes.

Une fois le protocole terminé, la grille est placée sur l’image de la membrane. L’utilisateur doit vérifier que la grille est correctement placée et peut replacer certains spots manuellement si nécessaires (voir Figure 5). Le logiciel attribue à chaque tache une valeur numérique (unité arbitraire). Ces données sont obtenues sous forme d’un tableau Excel et serviront pour l’analyse informatique.

b) Traitement du signal et normalisation de l’intensité des spots

Comme l’illustre la Figure 3, l’intensité du signal obtenu pour chaque spot est variable. L’intensité du signal dépend de plusieurs paramètres dus à la manipulation. Pour permettre de comparer deux expériences, il est impératif de normaliser les données. En effet, l’intensité d’un spot peut varier d’une expérience à l’autre en fonction de l’efficacité du marquage de l'ADN génomique, du temps d’exposition…

La normalisation s’effectue sur la moyenne des valeurs des taches pour lesquels il y a un signal d’hybridation. En effet, le nombre de taches ne donnant pas de signal est variable d’une souche à l’autre, et une normalisation seulement basée sur la moyenne de l’ensemble des points entraînerait une erreur significative.

Figure 6 : Intensité brute classées par ordre croissant resultant de l'hybridation d'une souche de L. monocytogenes provenant de Helsinki

A partir des résultats de quantification avec Array-vision®, une courbe correspondant à la valeur brute quantitative de chaque spot est tracée en fonction de cette valeur. Tous les gènes situés avant la cassure de la courbe ont une valeur non significative car ils sont situés dans le bruit de fond. La moyenne de l’intensité des spots est calculée à partir de ce point. Les valeurs sont finalement normalisées en divisant la valeur quantifiée par cette moyenne (Voir Figure 6).

c) Membrane virtuelle de références et détermination de valeur « ratio »

L’intensité d’hybridation donne une valeur relative et pour définir si un gène est présent ou absent, il est nécessaire de diviser ces valeurs normalisées par une valeur de référence normalisée obtenue avec un ADN génomique qui contient ce gène. On obtient alors les valeurs ratio. L’intensité normalisée de référence pour un gène est celle obtenue par hybridation avec les ADNg des souches matrices de la puce utilisés pour faire les PCR.

Pour déterminer ces valeurs de référence, les hybridations avec les ADNg de ces souches matrices ont été réalisées en triplicata. Une moyenne des trois valeurs normalisées est effectuée et une membrane virtuelle de référence est réalisée en combinant les valeurs d’hybridations des souches matrices.

d) Notion de seuil et d’ambiguïté

Zone d’ambiguïté : le seuil de coupure est définit à 30%

Figure 7 : Rapports classés par ordre croissant des intensités normalisées entre le signal et la référence en fonction des gènes (valeurs ratio), ADNg d’une souche L. monocytogenes en provenance de Helsinki hybridées sur la puce de 2eme génération

Le point critique dans l'analyse est de prédire à partir des valeurs ratio si un gène est présent ou absent. Expérimentalement un seuil de coupure est défini par rapport aux valeurs « ratio » qui permet de minimiser le nombre de faux positif sur la base de l'hybridation avec les génomes de séquence connue. Les valeurs « ratio » seront comparées à ce seuil de coupure et permettront de prédire l’absence ou la présence du gène au sein de l’ADNg. (Voir Figure 7)

Les signaux obtenus ne sont pas tous tranchés. Comme le montre la Figure 7, les valeurs des intensités de certains signaux se situent dans une zone d’ambiguïté où il est difficile de binariser le signal. D'une expérience à l'autre ce signal sera au dessus ou au dessous du seuil.

Les valeurs des ratio d’une hybridation de l’ADNg de EGDe ont été classé par ordre croissant et séparé selon si le gène est effectivement présent ou absents dans le génome. Il peut aussi exister des faux« négatif » c'est-à-dire que ces signaux auraient du être positif.

2. Comparaison et classification des souches

A l'aide des macro-arrays, on peut caractériser les génomes des souches par la présence ou non des gènes. L’hybridation de l’ADNg de plusieurs centaines de souches de listéria d’origines diverses (environnementales, cliniques ou portage) va permettre de constituer une base de données très importante mais difficilement interprétable. C’est pour cela que plusieurs algorithmes ont été appliqués pour être intégré à travers différents logiciels. Ces logiciels, comme J-Express, vont permettre de regrouper hiérarchiquement (classification hiérarchique) les gènes recherchés et les souches entre elles. Plusieurs études comparatives entre les souches sont rendues possibles grâce au regroupement hiérarchisé comme, par exemple, l’étude des souches d'origine clinique comparées aux souches environnementales.‎[9]

a) Traitement des données par J-Express

Après avoir défini le seuil de coupure permettant d’interpréter le signal pour une présence ou une absence de gènes, une matrice binaire, regroupant les gènes en fonction des souches, est créée. Cette matrice est incorporée dans le logiciel J-Express qui permet de réaliser le regroupement hiérarchisé par UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean).

Figure 8 : Interface du logiciel J-Express

J-Express réalise un double regroupement hiérarchique où à la fois les gènes et les souches sont comparés. Par l’intermédiaire d’un module graphique, J-Express construit un arbre où les souches en abscisse d’une part et les gènes en ordonnées d’autre part sont clustérisées regroupés. La présence de gène dans la souche est symbolisée par un pixel rouge. Une difficulté liée à la classification hiérarchique et l'utilisation des scores binarisés. Cette classification est donc très sensible aux scores des valeurs proches du seuil de binarisation.

b) « X strains » : une solution alternative pour regrouper les souches

L’analyse d’une membrane de typage implique une étape de décision pendant laquelle l’utilisateur doit décider si le gène, en fonction du signal et d’un seuil, est présent ou absent. Cette décision va influencer par la suite le regroupement hiérarchisé des souches étudiées entre elles.

« X-strains » est un progiciel développé par Christophe Rusniok de l'Unité GMP en complément de la méthode de classification hiérarchique dans le but de retirer cette étape de « binarisation » lors du traitement du signal des puces de typage. Il permet de former des groupe de souches tout en connaissant les distances (nombre de signaux comparés pour un gène significativement diffèrent) entre les souches. La méthode d’analyse est basée sur la comparaison souche par souche (une souche contre toutes les autres souches). Les souches qui sont identiques par cette méthode vont être regroupées. Cette nouvelle approche devrait permettre de définir des groupes des souches qui se ressemblent et de définir les souches qui sont proches ou identiques.‎[24]

3. Difficultés et solutions envisagées

Malgré l’intérêt des puces d’hybridations ADN/ ADN sur les autres techniques de typage par l’apport de connaissances génomiques, l'expérience acquise sur les puces de 1^ère et 2^ème génération a mis en évidence différentes difficultés (Tableau 2). Cette technique est limitée par le bruit de fond biologique et technique ainsi que par le pouvoir discriminatoire et la représentativité des gènes sélectionnés pour construire la puce.

Tableau 2 : Liste des difficultés rencontrées

	Difficultés rencontrées	Solutions envisagées
1	Certaines souches hybrident trop faiblement pour donner un signal interprétable malgré plusieurs tentatives.	Choix de la méthode d’extraction d’ADN donnant les meilleurs marquages.
2	Après normalisation, 17% en moyenne des signaux ont des valeurs ratio (comprise entre 0,2 et 0,4) proche du seuil de coupure de 0,3 et donc difficile à interpréter.	Améliorer le rapport signal/ bruit en choisissant les meilleurs sondes.
3	Après l’analyse par regroupement hiérarchique, le typage des souches peut être effectué. Cependant l’analyse de 739 gènes à travers le logiciel J-express montre que 27% des gènes apporte peu de poids en étant soit présents ou absents dans plus de 95% des souches.	Analyser la valeur de chaque gène dans l’information qu’il apporte réellement dans la discrimination des souches entre elles.
4	La puce à ADN se base essentiellement sur le génome de L. monocytogenes EGDe de sérovars 1/2a. Or, celle-ci clustérise par cette technique avec les L. monocytogenes de sérovars 1/2c. Par conséquent, cette souche n’est pas forcément représentative de la diversité des souches 1/2a	Intégrer à la nouvelle puce des gènes provenant d’une L. monocytogenes de sérovars 1/2a aspécifiques de EGDe.
5	Bien que les phages (non présent sur la dernière puce mise au point) n’apporte que peu d’information sur les Listeria du point de vue fonctionnelle, ils permettraient tout de même d’apporter un poids supplémentaires dans l’interprétation de la variabilité du génome de Listeria.	Réintégrer les gènes de bactériophages qui ont pu être écarté entre la puce 1 et la puce 2.
6	Certains gènes sont redondants, c’est-à-dire qu’ils appartiennent à un groupe de gènes qui donnent le même signal.	Choisir au sein de ces clusters les sondes qui donnent le meilleur signal.

a) Bruit de fond

La principale limite de cette technique d’hybridation moléculaire réside dans l’interprétation du signal attestant la présence ou l’absence de la séquence nucléique recherchée. Le bruit de fond, d’origine technique et biologique, est une des causes principales de cette limite.

En effet, le bruit de fond résultant en partie au moins d’hybridations croisées (causés par la présence de gènes paralogues) peut fausser l’interprétation du signal et générer de faux positifs dans le cas d’hybridations croisées et de faux négatif dans le cas d’un bruit de fond trop élevé. Les hybridations croisées sont variables entre les souches et les gènes. Le bruit de fond est aussi généré par le matériel utilisé lors de la manipulation. : C’est le bruit de technique. Les membranes de nylon et le scanner Typhoon® sont responsables de ce bruit de fond technique. Dans le cas de la méthode X-strains, l'importance des comparaisons de souches proches permet de réduire l'influence du bruit de fond biologique.

b) Pouvoir discriminatoire d’un gène déposé

Malgré le choix des gènes « déposés[5] » spécifiques de quatre génomes de listéria, certains gènes ayant une distribution homogène, c’est-à-dire présents ou absents dans toutes les souches, apportent peu de poids quant à la différentiation des souches par classification hiérarchique.

Il semble important de noter que la mise en évidence de gènes de phage peut permettre de mieux comprendre la relation entre deux souches similaires qui sont reconnues comme différentes par une analyse en champs pulsé. Enfin, Il serait nécessaire de diversifier la puce en complétant les sondes définies à partir du génome de la souche EGDe par des gènes spécifiques de la souche L. monocytogenes de sérovars 1/2a séquencée par l’institut de génomique TIGR[6]‎[22].

4. La puce de typage de 3eme génération

Le but de la mise au point d’une puce de 3eme génération est de proposer un outil de typage plus efficace en mettant à profit l’expérience sur les deux autres puces avec moins de contraintes en terme d’analyse (réduction du nombre de taches à analyser) avec des signaux plus tranchés sans ambiguïté tout en gardant la représentativité des gènes à travers les diffèrent génomes de listéria séquencés. Il s’agira en particulier de résoudre les difficultés énoncées dans le Tableau 2.

Cette mise au point a été effectuée par plusieurs étapes :

Ø Une synthèse des résultats des puces de première et deuxième génération.

Ø Une sélection des gènes présentant un potentiel discriminant important et sans ambiguïté dans le but de réduire le bruit de fond biologique.

Ø Une étude sur influence des différentes étapes des développements et d’utilisation des puces à ADN (produits PCR, extraction ADN, température d’hybridation, membrane de nylon, concentration de l’ADN génomique matrice pour l’amplification des sondes) dans le but de réduire le bruit de fond technique

II. Matériels et méthodes

À partir des données obtenues par les puces de 1ere et 2eme génération et des souches matrices, une sélection de gènes est effectuée pour la création de cette nouvelle puce dite de « troisième génération » (puce 3G). Les critères de sélection sont définis de manière à écarter les gènes qui présentent une hybridation croisée ou apportant peu d’information. Les fragments spécifiques des gènes sélectionnés seront alors amplifié par PCR. Les amplicons seront vérifiés par électrophorèse sur gel et par séquençage avant d’être déposés sur la membrane.

Ensuite, le protocole d’analyse de la puce seront décrit pour le logiciel Array-vision® de tel manière à utiliser la nouvelle puce en routine. Les souches matrices ainsi que les souches références seront hybridées sur la nouvelle puce pour construire la première base de données.

A. Souches bactériennes

1. Souches matrices

Les souches matrices (Voir Tableau 3) sont utilisées pour amplifier par PCR l’ADN des gènes «à déposer », et pour les hybridations des puces permettant de réaliser la membrane de référence virtuelle.

Tableau 3 : Souches matrices utilisées pour le développement de la nouvelle puce

Souche matrice	sérovars	indicatif gènes correspondant
L. monocytogenes EGDe	1/2a	Lmo
L. monocytogenes (CLIP80459)	4b	Lm4b
L. monocytogenes (CLIP90602)	1/2b	Lm12b
L. innocua (CLIP11262)	6a	Lin
L. monocytogenes TIGR F6854	1/2a	Tg12a
L. monocytogenes TIGR F2365	4b	Lm4b-T

*CLIP : Collection Listéria Institut Pasteur

2. Souches testées sur la nouvelle puce

Pour construire la base de l’arbre de regroupement hiérarchique, nous avons choisi d’hybrider les souches de références de différents sérovars de toute les espèce du genre Listeria. Ces souches sont la référence pour leur espèce et leur sérovar. Pour tester la performance et le pouvoir discriminatif de la nouvelle puce, d’autres souches seront hybridées sur la nouvelle puce. 10 souches du CDC responsables d’épidémie aux Etats- Unis‎[10], 4 souches isolées en Finlande responsable d’épidémie, ainsi que 3 souches isolées en France dont 2 proviennent des industries alimentaires (Voir Tableau 4).

Tableau 4 : Descriptions des souches à hybrider sur le la puce 3G

Souches de références			Autres souches hybridée sur la puce 3G
Espèce	sérovars	CLIP	dénomination	sérovars	information°
L. monocytogenes	1/2a	74902	CDC de 1 à 10	4b	Souches de L. monocytogenes du control desease center of Atlanta
	1/2b	74903	3H	1/2c	Souches L. monocytogenes provenant de l’université de Helsinki
	1/2c	74904	5H	1/2c
	3a	74905	9H	1/2a
	3b	74906	12H	1/2b
	3c	74907	CLIP933666	1/2a	L. monocytogenes Portage femme enceinte 1991
	4a	74908	CLIP93149	12a	L. monocytogenes Filière Lait Epoisse 2001
	4b	74910	CLIP93655	1/2a	L. monocytogenes Entremont environementale
	4c	74911
	4d	74912
	7	74917
	3c	85412
L. innocua	6a	74915
	6b	74916
	4ab	74909
L. ivanovii	5	74914
L. welshimeri	6b	74020
L. seeligeri	1/2bnc	86579

B. Données utilisées pour la sélection des gènes

Les données utilisées pour la sélection des gènes à déposer sur la puce 3G sont d’une part les tableaux regroupant les valeurs ratio de la puce 1 et de la puce 2 et d’autre part l’accès aux génomes des souches matrices sur le site de « génolist[7] » de l’Institut Pasteur sous la forme de fichier IPF[8] et sur le site de TIGR.

Un tableau de comparaison des quatre génomes des souches EGDe, L. innocua, L. monocytogenes 4b et 4b TIGR a été préalablement effectué. Le génome de L. monocytogenes 1/2a TIGR a été comparé aux quatre génomes précèdent par l’intermédiaire d’un programme développé par Christophe Rusniok basé sur l’algorithme de Blast.

C. Construction de la puce

La réaction de polymérase en chaîne (PCR) pour obtenir des amplicons de gènes est une étape cruciale dans la réalisation des membranes d’hybridation ADN/ADN. C’est pour cela qu’il est important d’en étudier son influence pour en contrôler ses conséquences sur le signal de la puce. Cette étude se portera sur la concentration d’ADN génomique à amplifier et sur l’influence de la qualité de la PCR sur le bruit de fond.

1. Dessin des oligonucléotides

Les oligonucléotides correspondant aux souches des génomes séquencés par l’unité GMP ont été préalablement définis et sont accessibles directement à partir de la base de données du laboratoire. En ce qui concerne, les génomes des souches de TIGR, les oligonucléotides ont été dessinés avec le logiciel Primer 3[9]. Les oligonucléotides sont dessinés de manière à ce que les amplicons des gènes ont une taille comprise entre 400 et 600pb.

2. PCR en masse des gènes sélectionnés

Les réactions d’amplification par PCR « en masse » pour la préparation de la macro-array sont réalisées en plaque 96 puits. Pour chaque réaction de PCR, un mélange réactionnel est réalisé (Voir Tableau 5)

Tableau 5 : Mélange réactionel pour la PCR et programme utilisé pour le thermocycleur (GeneAmp)

Réactif (Applied)	Volume	Concentration		temps	températures	Nbre cycles
ADN génomique dilué	1 ml	A déterminer		5’	94°C	1 cycle
dNTP (10 mM)	2 ml	10 mM		30’’	94°C	30 cycles
Mgcl2 (25 mM)	8 ml	25 mM	à	1’	50°C
tampon 10X	10 ml	10X		1’	72°C
Taq polymérase	0,5 ml	5UI/ml		7’	72°C	1 cycle
eau distillée	qsp 90 ml			∞	4°C	-

Dans chaque puits de la plaque PCR, il faut mettre 10 ml d’amorce (10 mM) spécifiques de la sonde à amplifier et 90 ml de mélange réactionnel sont ajoutés respectivement. Le volume de la réaction est donc de 100 ml. Le programme de la réaction d’amplification est aussi décrit dans le Tableau 5.

3. Vérification des produits de PCR par séparation par électrophorèse sur gel d’agarose

Pour vérifier l’amplification, la concentration et la spécificité des produits de PCR attendu, ils sont déposés sur gel 1% d’agarose en tampon TBE 1X (Tris Borate EDTA). La révélation s’effectue avec du BET[10].

Pour chaque gène, 10 ml de produit de PCR et 4 ml de tampon de charge sont déposés. En parallèle des produits de PCR, 3 ml de marqueur de poids moléculaire (Smart ladder) sont déposés afin de pouvoir déterminer la taille de chaque amplification. Après la migration, le gel est exposé par exposition aux rayons UV pour révéler l’ADN marqué au BET.

4. Dépôt des produits PCR sur membrane de nylon

Après l’amplification et la vérification, les amplicons de gènes sont déposés sur une membrane en nylon pour constituer une macro-array.

a) Principe de la fixation de fragment d’ADN sur membrane

La fixation de l’ADN sur un support se fait soit directement par interaction entre les groupes phosphates de l’ADN et les cations de la membrane (membranes chargées), soit par irradiation aux UV ou cuisson sous vide, ce qui fixe de manière covalente l’ADN à la membrane (membrane non chargée). La dénaturation de l’ADN pour le rendre simple brin se fait par traitement alcalin. Dans le cas présent, des membranes chargées positivement seront utilisées. Les produits de PCR doubles brins qui sont déposés se fixent donc par covalence et sont dénaturés par une solution de NaOH/NaCl et par un traitement aux UV.

b) Caractéristiques des membranes et pilotage du robot Qpix

Les membranes utilisées ont une dimension de 22,2 x 22,2 cm. Avec une membrane de cette taille, on obtient 6 « petites » membranes, chacune contenant l’ensemble des amplicons de gènes. Les amplicons de gènes sont déposés en duplicata sur la membrane à l’aide du robot Qpix (Genetix).

Figure 9 : Interface du logiciel de pilotage « Gridding » du Qpix de Genetix

Le logiciel « Gridding » (voir Figure 9) permet de définir les paramètres indiqués dans le Tableau 6 avec lesquels la membrane à haute densité sera réalisée. Dans ce logiciel, tout d’abord le nom de la feuille de route est choisit, le type de plaques dans lesquelles se trouvent les gènes à déposer (plaque 96 ou 384 puits), le support de la membrane (bloc ou boîte), le nombre de champs à réaliser sur la membrane, le praton (nombre de fois et positions où sera déposée une même sonde), les différents temps et nombre de fois ou les aiguilles seront lavées dans l’éthanol et dans l’eau, et la tête du robot à utiliser (96 ou 384 aiguilles).

Tableau 6 : Paramètres de pilotage du Qpix pour le dépôt des sondes sur la macro-array

Paramètres
Tête	384 PIN Gravity gridding
Plaque source	Abgene plaque 384 well
Spot par gène	2 réplicats
Lavage : éthanol/eau	4/4
Séchage	5 secs
Distance entre deux patterns	2500 mm
Nombres de dépôts par spot	5
Temps sur membrane (aiguilles)	2000 ms
Temps dans un puit (aiguilles)	1000 ms

D. Utilisation de la puce

1. Marquage radioactif de l’échantillon d’ADNg

L’ADNg est dénaturé par la chaleur (99°C) pour obtenir de l’ADN simple brin. Le marquage est réalisé par la méthode de l’initiation aléatoire. Cette méthode est basée sur un mélange de tous les hexanucléotides possibles pouvant s’hybrider sur n’importe quel partie de l’ADN. Le brin complémentaire est synthétisé à partir de ce mélange par l’intermédiaire de l’enzyme Klenow. Les quatre désoxynucléotides dont un seul est marqué radioactivement par le ³³P (il s’agit du dCTP) sont incorporé dans la synthèse du nouveau brin d’ADN.

a) Marquage de l’ADNg

10 ml d’ADN (5 ng/ml) sont dénaturés en thermocycleur pendant 10 minutes à 99°C. Les tubes sont immédiatement mis dans la glace pour éviter la réassociation des deux brins. Pour effectuer le marquage, on utilise le kit « Random Priming DNA Labeling » de chez Roche. Aux 10 ml d’ADN dénaturé, les réactifs suivants sont ajoutés :

Ø 1 ml dGTP (0,5 mM)

Ø 1 ml dTTP (0,5 mM)

Ø 1 ml dATP (0,5 mM)

Ø 2 ml mélange réaction (tampon + hexamères)

Ø 5 ml ³³P dCTP

Ø 1 ml enzyme de Klenow

Le volume final de la réaction de marquage est de 21 ml. La réaction de marquage se fait durant 45 minutes à 37°C en thermocycleur. La réaction est arrêtée en ajoutant 2 ml d’EDTA 0,2M pH=8

Remarque : l’ajout d’EDTA 0,2M pH=8 n’est pas nécessaire si l’ADN est purifié dès la fin du marquage.

b) Purification de l’échantillon

Les ADN néosynthétisés à partir de l’ADNg sont purifiés et séparés des nucléotides, marqués ou non, non incorporés par le kit Qiaquick Nucleotide Removal. Les nucléotides non incorporés, sont éliminés pour éviter un signal aspécifique.

L’ADN est purifié sur colonne comprenant une membrane qui retient des fragments d’ADN ayant une taille supérieure à 17 bases. La liaison de l’échantillon d’ADNg à la membrane est facilitée à forte concentration en sel. Après deux lavages successifs pour éliminer tous les contaminants, l’échantillon est éluée en diminuant la concentration en sel et en augmentant le pH.

10 volumes de tampon PN sont ajoutés à un volume d’ADN marquée. La réaction de marquage se faisant dans un volume de 21 ml, 210 ml de tampon PN sont ainsi ajoutés. Les 231 ml de solution sont déposés sur la colonne puis centrifugée une minute à 6000 rpm. L’ADN est retenue sur la colonne. La colonne est placée sur un nouveau tube Eppendorf et lavée avec 500 ml de tampon PE. Après une minute de centrifugation à 6000 rpm et après avoir éliminé le filtrat, un deuxième lavage est effectué avec à nouveau 500 ml de tampon PE. Après retrait du filtrat, la colonne est centrifugée 1 minutes à 13000 rpm avant d’être placée sur un tube Eppendorf afin d’éluer l’échantillon avec 200 ml de tampon d’élution EB. L’élution s’effectue par une centrifugation d’une minute à 13000 rpm.

c) Dénaturation de l’ADNg marquée et purifiée

Après avoir purifié l’échantillon, on le dénature par passage à 99°C afin d’avoir de l’ADN simple brin pouvant s’hybrider avec les ADN déposés sur la membrane en cas de complémentarité. En éluant par 200 ml de tampon EB, l’échantillon est dénaturé pendant 10 minutes à 99 C puis laissé à 4°C avant d’être ajouté à la solution d’hybridation.

2. Hybridation

Avant d’hybrider l’échantillon d’ADNg sur la membrane, cette dernière est saturée avec 10 mL une solution d’hybridation (Voir Tableau 7) contenant du Denhardt’s (Sigma) et de l’ADN qui provient de sperme de saumon qui se fixe sur la membrane « vierge » d’ADN. Cette étape permet d’éviter la fixation non spécifique de l’ADN sur la membrane. Après avoir préchauffé la solution d’hybridation à 60°C, la membrane est préhybridée une heure à 60°C dans 10 ml de cette solution sous rotation dans un four à hybridation.

Tableau 7 : Solution d’hybridation pour une membrane

SSPE 10X	7,5 ml	Composition SSPE 10X
SDS 10%	3,5 mL	NaCl 5M	360 mL
Denhardt’s 50X	0,3 mL	EDTA 0,5M pH=8	20 mL
ADN saumon 10µg/µL	3µL	NaH2PO4 1M	86,7 mL
H2O	4,5mL	Qsp 1L d’eau distillée

a) Hybridation de l’ADNg marqué aux cibles d’ADN immobilisées (sondes) sur membrane

La réaction d’hybridation met en jeu deux chaînes d’ADN simple brin (la cible et l’échantillon). Pour choisir la température d’hybridation, il faut tenir compte de la température de fusion qui est la plus importante, de la taille de la cible, sa teneur en GC%, la succession de 3A, 3T, 3C et 3G, la concentration en ions monovalents et en agents déstabilisant (formamide ou urée).

L’ADNg marquée et dénaturée est ajoutée à 5 ml de solution d’hybridation. Cette solution est incubée sur la membrane après avoir éliminé la solution de préhybridation. L’hybridation se fait sur la nuit à 60°C sous rotation.

b) Lavages de la membrane

Une fois l’hybridation terminée, la solution d’hybridation contenant l’excès d’échantillon[11] est éliminée et la membrane est ensuite lavée par plusieurs lavages successifs qui permettent d’éliminer l’excès d’échantillon ou d’ADN qui se sont hybridées de manière aspécifique. Ces lavages sont effectués à la même température que l’hybridation. Ainsi, on est à forte astringence ce qui permet de conserver les hybridations spécifiques et de déstabiliser les liaisons faibles entre deux séquences d’ADN non parfaitement complémentaire.

La membrane est lavée deux fois trois minutes à température ambiante sous agitation dans une solution de lavage (50 ml SSPE 10X, 20ml SSC 2X qsp 1L d’eau distillée). La solution est ensuite incubée à 60°C afin de réaliser deux lavages de 20 minutes sous agitation à 60°C. Après les différents lavages, la membrane est mise entre deux feuilles plastiques qui sont ensuite soudées tout en vérifiant bien qu’il n’y ait ni bulles ni plis. La membrane ainsi « plastifiée » est de nouveau soudée dans un second plastique pour éviter de contaminer l’écran qui sera déposé sur la membrane dans la cassette. L’écran est exposé à la lumière pour être totalement désactivé avant d’être exposé sur la membrane. Ce dernier capte l’énergie de la radioactivité provenant de la membrane. L’écran est exposé deux jours sur la membrane. A la fin de la manipulation, par exposition à la lumière, l’écran est effacé pour être réutilisé avec une nouvelle membrane.

c) Révélation de l’hybridation

L’écran est scanné grâce à un PhosphorImager (Typhoon, Amersham) qui détecte l’intensité de la radioactivité des différents spots mais aussi de la membrane émise par l’écran. Le balayage est réalisé avec une taille de pixel de 100 microns. Plus la taille de pixel est faible plus la résolution est haute.

d) Déshybridation de la membrane

Une fois que la membrane est scannée, elle peut être déshybridée et réutilisée pour une nouvelle hybridation. Chaque membrane peut être utilisée 4 à 5 fois. La technique de déshybridation à la soude est utilisée : la membrane est placée dans une solution de NaOH 0,5M durant 30 minutes sous agitation. Elle est ensuite rincée à l’eau distillée, trempée rapidement dans une solution de SSC2X et conservée à -20°C.

Remarque : gestion des déchets radioactifs et surveillance des contaminations radioactives

Les manipulations contenant une étape de manipulation d’isotope radioactif sont soumis à des contraintes de sécurité. Un poste dans le laboratoire doit uniquement servir à cet effet. Ce poste est décontaminé après chaque manipulation. Chaque manipulateur reçoit une formation de sensibilisation à la radioactivité. Tous les déchets radioactifs (solide et liquide) sont triés pendant la manipulation. L’Institut Pasteur prend en charge la gestion et la décroissance des déchets radioactifs. Ainsi peu de laboratoires ont accès aux manipulations contenant de la radioactivité.

3. Analyse des membranes

Une fois que les membranes ont été scannées, elles sont analysées grâce au logiciel Array-vision®. Plusieurs étapes sont nécessaires avant de pouvoir faire l’analyse des nouvelles puces :

Ø Construire la nouvelle membrane de référence

Ø Définir le nouveau protocole d’analyse dans Array-vision

Ø Traiter le signal (comme indiqué en ‎I.D.1) pour construire une nouvelle base de données

III. Résultats et interprétations

A. Sélection des gènes à déposer

Plusieurs simulations « in silico » ont été nécessaires avant d’adopter une stratégie pour réaliser une sélection des gènes à déposer sur la membrane. Au cours de cette sélection, il faut aussi veiller à la représentativité des gènes dans le but de garder le pouvoir discriminatif de la puce « biodiversité ».

1. Simulation « in silico »

Pour réaliser efficacement une sélection des gènes provenant des puces de 1ere et de 2eme génération, une étape in silico a été nécessaire par l’intermédiaire de simulation sur le logiciel J-express après analyse de l’information sur le tableur Excel afin de vérifier à la fois le potentiel discriminatoire mais également la représentativité des gènes choisis pour la puce 3 G.

La sélection des gènes a été basée sur plusieurs critères d’analyse de données à la fois biologiques et qualitatifs :

Ø Les sondes sélectionnées doivent donner un signal non ambigu, car les sondes générant des hybridations croisées sont responsables des signaux ambigus et conduisent à un biais dans l’analyse des résultats de typage

Ø L’ensemble de sonde sélectionnée doit avoir le même pouvoir discriminatoire que celui des puces construites auparavant.

Ø Les sondes sélectionnées sont aussi celles qui sont importantes/impliquées dans l’interaction de L .monocytogenes et l’environnement et les facteurs de virulence connues (motif LPXTG, famille des internalines, …).

Ø Nous effectuons aussi le choix de ne prendre qu’une sonde pour des gènes organisés en opéron qui donne une fréquence de signaux identiques

Ø Les gènes présents ou absents dans toutes les souches ne sont pas discriminants pour permettre de mettre en évidence des sous-groupes au sein des sérotype de L. monocytogenes.

a) Ecarter les gènes donnant des signaux ambigus.

L’utilisation de J-express passe tout d’abord par une étape sur le tableur Excel de Microsoft. La comparaison de l’intensité du signal d’un gène en fonction des différents critères est effectuée par l’intermédiaire d’un test logique de condition « if then else » (voir Figure 10).

Figure 10 : Organigramme décisionnel "if then else"

Les critères de sélection sont définit en fonction de la valeur du ratio et de la répartition du signal dans toutes les souches testées. Un signal est dit trop ambiguë lorsque la valeur de son ratio se situe entre 0,2 et 0,4 dans plus de 5 % des souches testées. Les signaux présentant des caractéristiques de manière générale trop ambiguë sont écartés de cette manière. Cette technique sera appliquée sur toutes les souches mais également à l’intérieur des souches du même sérovars. Dans les deux cas, 200 gènes seront sélectionnés.

Remarque : L’hybridation de EGDe avec la puce de 2eme génération produit 12,7% de signaux ambigus.

b) Ecarter les gènes qui apporte peu d’information pour discriminer les souches

De la même manière que précédemment à l’aide d’un test logique sur le tableur Excel, les gènes donnant des signaux « identiques » pour toutes les souches seront écartés. Un signal est dit identique dans toutes les souches si l’hybridation donne la même réponse dans plus de 95% des souches.

c) Écarter les gènes ortho logues

Par l’intermédiaire du développement d’une macro (Tableau 8) un test de comparaison de génome est effectué pour retirer les sondes en « doublon » provenant de deux génomes.

Tableau 8 : Macro sub test() applicable sur les logiciels Office Mac OS

Sub test()	Definition de la macro
For Each o In Range("B1:B" & Range("B65000").End(xlUp).Row)	Pour tout les élément de la colonne B on définit une valeur « o »,
Set FD = Range("D1:D" & Range("D65000").End(xlUp).Row).Find(o.Value)	Pour tout les élément on définit un variable FD définit par la recherche des valeurs « o »
If Not FD Is Nothing Then	Si La variable FD existe réellement
z = FD.Address	On définit une valeur “z”
o.Offset(0, -1).Value = Range(z).Offset(0, -1).Value	« z » est alors égale à la valeur de la colonne de gauche de D et sera inscrit dans la colonne à gauche de B
End If	Fin de la condition
Next	Cette opération est réalisée pour toutes les cellules
End Sub	Fin de la macro

Cette macro va permettre de comparer deux colonnes dans un tableau Excel et lui attribué une valeur. Ces deux colonnes peuvent être par exemple les gènes des génomes de EGDe et de L. innocua. Cependant il faut utiliser un feuillet où la comparaison des génomes avait déjà été effectuée par Blast pour pouvoir adapter cette information a la liste gène de la puce dans une autre colonne.

La Figure 11 montre en colonne C et D les génomes de L. monocytogenes EGDe et L. innocua. Ces génomes ont été préalablement comparés par Blast c'est-à-dire que les gènes se trouvant sur la même ligne sont orthologues. On souhaite rechercher dans les gènes amplifiés à partir de L. innocua présent sur la puce (colonne B) les gènes lmo en colonne A (L. monocytogenes EGDe) orthologues. Le gène lin0059 va être recherché dans la colonne D (voir chemin 1 Figure 11). La macro trouve la correspondance dans la colonne C avec le gène lmo0066 et va le reporter en colonne A en face du gène voulu (voir chemin 2 Figure 11). En revanche, lorsque que la macro ne trouve pas de correspondance, elle n’inscrit rien en face des gènes recherchés et passe à la ligne suivante (voir chemin 3 Figure 11).

3

2

1

Figure 11 : Illustration de l'utilisation de la macro « subtest » dans la cas d'une recherche rapide de gènes lin dans le génome de EGDe

Cette macro va permettre de comparer rapidement en un seul clic plusieurs listes de gènes. Elle permettra d’écarter par exemple les gènes en doublon sur la puce ou bien de manière plus pratique de faire les correspondances entre le système d’annotation progressif du génome (fichier IPF) et les annotations finales. Cette macro permet également de mettre en relation plus facilement les données obtenues avec les anciennes puces et la puce actuelle pour des simulation de groupage de souches in silico sur J-Express.

2. Stratégie de la sélection des gènes

Trois grandes étapes de sélection des gènes ont été effectuées dans le but de réduire le nombre de gènes présents sur la puce tout en préservant l’information sur la virulence et enfin diversifier la puce par l’ajout de nouveau gènes.

La Figure 12 illustre la procédure de sélection des gènes à partir des données des précédentes puces et des données des génomes de TIGR. Pour toutes ces étapes de sélection in silico, la macro « subtest » a été utilisé en complément des fonctions de base de Excel.

Figure 12 : Présentation des étapes de selection des gènes

Dans un premier temps, à l’aide de critères sélectifs, une puce virtuelle a été construite sur la base d’une trentaine de gènes seulement. Cette puce virtuelle d’une trentaine de gènes est un squelette de la future puce. Néanmoins les gènes seront sélectionnés de manière à ce que cette puce soit assez discriminante pour différencier les sérovars. Pour cela 200 gènes seront sectionnés par des critères de qualité (absence d’ambiguïté et une fréquence de signal différentes en fonction des sérovars) et 200 gènes seront sélectionnés dans leur pouvoir à discriminer les sérovars entre eux (Voir Figure 10 et cf. ‎III.A.1.a)). Les gènes communs à ces deux ensembles de gènes constituent le squelette de la future puce.

Figure 13 : Analyse en Composantes Principales d’une simulation « in silico », d’hybridation de 10 souches de référence avec les 31 sondes choisis dans la Figure 12

La Figure 13 illustre l’Analyse en Composante Principale d’une simulation avec les 31 sondes choisis comme « individus » et 10 souches de référence comme « variable ». Le plan formé par les 2 axes représentés possède une inertie de 66%. Ceci confère à la figure un poids suffisant pour évaluer le pouvoir discriminatif des 31 sondes choisis. Les vecteurs formés par les « variables » souches permettent de constater que chaque sérovars est bien séparés. Les souches L. innocua sont bien séparées des L. monocytogenes. Au sein des souches L. monocytogenes, les sérovars sont séparés et suivent la loi de division génomique représenté à la Figure 2. En ce qui concerne les sondes, il est intéressant de remarquer que la sonde lmo0066 participe de manière importante aux sous groupage des L.innocua 6a. Ceci corrèle bien avec la comparaison des génomes illustrés sur la Figure 11avec la macro « subtest ».

Dans un deuxième temps les gènes importants donnant des informations cruciales seront apportés comme par exemple les gènes de virulence (qui ne sont pas forcement discriminant) ‎[6]. Pour cela, l’apport de ces gènes sera conforté par les résultats obtenus auparavant avec la puce 1ère génération ‎[7].

Enfin, dans un troisième temps, Pour être plus discriminatoire, il est nécessaire de diversifier la puce par l’intégration de gènes spécifiques supplémentaires, issus des séquences de d’autres génomes de souches de L. monocytogenes mais également par l’intégration de gènes phagiques, en utilisant des banques de séquences.

Ø Les autres génomes séquencés de Listeria, analysées également dans l’unité, proviennent de l’institut de recherche génomique TIGR. Ces deux séquences proviennent de deux souches de L. monocytogenes de sérovars 1/2a et 4b. Ces génomes 1/2a et 4b de TIGR ont été comparés par Blast avec les séquences du génome de L. monocytogenes EGDe, L. innocua (CLIP11262) et L .monocytogenes 4b (CLIP80459). Les séquences qui ont une homologie inférieure à 70% seront retenues pour ne sélectionner que les gènes spécifiques.

Ø Intégration des gènes phagiques : ils sont une source à la variabilité des génomes de Listeria. En effet, un pulsotype différent peut résulter de l’intégration d’un phage.

3. Représentativité des gènes

L’objectif est que le nombre de gènes sélectionnés doit être le plus représentatif de Listeria et surtout de l’espèce L. monocytogenes, car c’est celle qui est responsable de la quasi-totalité des cas de listériose. La puce finale de la 3eme génération (puce 3G) est composée de 317 gènes. Le Tableau 9 présente le nombre des gènes sélectionnés qui ont été spottées sur la puce 3 G en fonction des souches matrices.

En outre, 165 gènes de la puce sont présents dans le génome de EGDe, dont 59 lui sont spécifiques. 155 amplicons seront réalisés à partir de l’ADNg de EGDe. Pour les sondes dérivées des souches de Listeria autres que EGDe, les amplicons de chaque gène ont été réalisés à partir de 35 paires d’amorce dessinée à partir de la séquence de L. innocua CLIP11262, 61 paires à partir de la séquence de L. monocytogenes CLIP80459 (lm4b), 16 paires L. monocytogenes F2365 (lm4b-T) et 48 paires à partir de la séquence de L. monocytogenes F6854 du sérovar 1/2a (tg1/2a) et une paire d’amorce à partir de la séquence de L. monocytogenes CLIP90602 du sérovar 1/2b (lm12b).

Tableau 9 : Nombre de gènes choisis en fonction de leur spécificité, de leur présence ou absence par rapport aux souches matrices.

Gènes	Présent	Non présent	Spécifique	amplicons
EGDe (lmo)	165	152	59	155
lm4b	157	160	11	61
lin	111	206	23	35
lm4b-T	148	169	13	16
Tg12a	nd	nd	48	48
lm1/2b	nd	nd	1	1

Légende : lmo pour les gènes de EGDe ; lm4b pour les gènes de L. monocytogenes 4b ; lin pour L. innocua 6a ; lm4b-T pour L. monocytogenes 4b séquencés par TIGR ; tg12a pour les gènes de L. monocytogenes 1/2a séquencés par TIGR ; lm12b pour les gènes de L. monocytogenes 1/2b.

Les gènes sélectionnés important pour la virulence ou la différenciation des sérovars de L. monocytogenes ont été choisies sur la base des résultats de la première membrane (cf. ‎I.A.3) De plus 25 gènes d’origine phagique de Listeria qui faisait défauts dans les anciennes puces ont été ajouté.

B. Caractéristique et influence du matériel

1. Étude de concentration minimale et nécessaire pour la PCR

Une étude de l’influence de la concentration de départ d’ADN génomique sur la PCR a été réalisée pour déterminer la concentration minimale et nécessaire pour une amplification PCR importante. Le but de cette étude est d’utiliser le minimum d’ADN génomique pour minimiser le bruit de fond dû à l’hybridation avec cet ADN.

D’après la Figure 14, la réaction de PCR est variable selon les gènes à amplifier. Sur cet exemple, les dilutions ont été faites à partir d’un aliquote d’ADNg de L. innocua de concentration 367µg/ml. Le puit 3 et le puit 11 semble donner une amplification nécessaire et suffisante soit une concentration de 3,6ng/µL. Pour effectuer les PCR en masse, il est nécessaire de trouver une concentration consensus pour tous les ADNg et pour tous les gènes à amplifier.

500pb =>

Figure 14 : Photo de migration sur gel en électrophorèse pour une étude de l’effet de la dilution sur l’amplification par PCR de deux gènes de L. innocua. M= marqueur de poids moléculaire Smart Ladder.

Tableau des dilutions		10^-2	2.10^-3	10^-3	2.10^-4	10^-4	2.10^-5	10^-5	2.10^-6
N° Puits	Lin0060	1	2	3	4	5	6	7	8
N° Puits	Lin0064	9	10	11	12	13	14	15	16

Sur l’ensemble des tests qui ont été effectué, l’amplification PCR est bonne lorsque que la concentration de l’ADNg à amplifier est au moins de 3,5 ng/µL, la concentration qui a donc été choisie pour l’amplification en masse.

2. Comparaison des signaux d’hybridation en fonction de la qualité de produits PCR spot

Lors de l’amplification par PCR en masse, il intéressant de noter que l’amplification varie en quantité et en qualité selon les gènes. Il semble alors intéressant d’étudier à travers l’élaboration d’un prototype l’influence de l’amplification PCR sur l’intensité du signal et la formation systématique de faux négatif ou faux positif lors de l’analyse. J’ai construit un prototype va être construit avec 192 gènes sélectionnés de EGDe et L. monocytogenes 4b.

Figure 15 : Photo sous UV d’un gel de migration en electrophorèse de 96 amplicons de gènes lmo

Qualité d’amplification	illustrations	résultats
Peu ou pas d’amplification		génération de faux négatif
Présence de double bande		génération de faux positif systématique
Bonne amplification		Bonne sonde

Ces différents produits PCR ont été utilisés pour construire une puce prototype qui a été hybridée avec les ADNg des souches EGDe et 4b pour déduire l’influence de produits PCR sur l’intensité des spots. Il résulte que la qualité du signal dépend de la qualité du produit PCR.

3. Influence de la température sur l’hybridation

Pour l’étape d’hybridation, il a été nécessaire d’étudier l’influence de température d’hybridation en réalisant parallèlement une hybridation à 60°C et à 65°C avec le prototype.

Figure 16 : Intensités normalisées classées par ordre croissant Hybridation de la souches EGDe sur le prototype aux température de 60°C et 65°C

Figure 17 : Intensités normalisées situées dans le bruit de fond

La température influence la stringence. Plus la température est basse plus la stringence est basse. Une faible stringence peut être intéressante pour les gènes présentant un polymorphisme élevé (par exemple un gène de L. innocua par rapport à une sondes d’ADNg de L. monocytogenes). Cependant une faible stringence augmente le bruit de fond (Voir Figure 17). Malgré une température élevée dans les plus hautes intensité, la température de 60°C a été choisi pour baisser la stringence et permettre aux ADN des autres espèces de Listeria de s’hybrider sur la puce (Voir Figure 16).

4. Influence des différents lots de membrane

La membrane peut être une source de bruit de fond technique. Quatre lots de membrane ont été préparées avec les 317 gènes sélectionnés pour la puce 3 G puis comparées par hybridation de l’ADNg de EGDe. La différence entre ces quatre types de membrane (Performa2 ; Millipore, NC2015 et Amersham) se fait sur le bruit de fond et sur la zone d’ambiguïté.

Zone ambiguïté

Bruit de fond

Figure 18 : Valeur ratio classé par ordre croissant

La Figure 18 présente les valeurs ratio d’une hybridation de la souche EGDe sur la puce 3G avec les quatre lots de membrane. Les valeurs ratio diffèrent peu d’un lot de membrane à l’autre. Il faut s’appuyer sur le bruit de fond et la zone d’ambiguïté pour designer la meilleure membrane de nylon.

Figure 19 : Valeurs ratio situé dans le bruit de fond

La Figure 19 illustre les 50 premiers spots qui donnent des signaux dans le bruit de fond. Il semble que la membrane d’Amersham ait un bruit de fond moins élevé.

La Figure 20 montre la zone d’ambiguïté où se situe le seuil de coupure.

faux négatif

faux positif

vrai négatif

vrai positif

Figure 20 : Seuil de coupure et zone d’ambiguïté

Théoriquement, L’ADNg de EGDe n’hybride pas sur les 148 premières sondes (Voir Tableau 9). Le seuil de coupure étant placé à une valeur ratio de 0,3, le nombre de faux négatif et de faux positif peut donc être dénombré. Dans cette étude, la membrane de nylon d’Amersham semble être la plus juste car elle ne forme ni de faux négatif ni de faux positif.

Cependant, il faut émettre des réserves à ces observations car finalement le seuil de coupure fixé à 0,3 (définit expérimentalement avec les puces précédentes) peut être maintenant différent avec cette nouvelle puce.

Tableau 10 : Proportion de valeur ratio se situant dans la zone d'ambiguïté définit entre 0,2 et 0,4

Membrane	performa 2	millipore	NC2015	Amersham
% de signaux ambigus*	5,21%	6,78%	5,84%	4,42%

*hybridation avec ADNg de EGDe

D’après le Tableau 10, la proportion de signaux ambigus est plus faible en utilisant la membrane Amersham. Cependant, la différence de proportions entre les membranes est faible.

Remarque : Dans tous les cas, la proportion de signaux ambigus est bien inférieure avec celle observé pour l’hybridation de l’ADNg de EGDe avec la puce de 2eme génération (12,7%).

C. Utilisation de la puce 3G

1. Comparaison de kits d’extractions d’ADNg à analyser

Afin que la puce 3G soit utilisée à travers tous les laboratoires intéressés par cette méthode de typage, notamment l’AFSSA de Ploufragan, il est nécessaire de comparer les méthodes d’extraction d’ADNg.

En partenariat avec l’AFSSA, deux kits d’extractions d’ADN génomique, Wizard et Quiagen, ont été testés. Les experts de l’AFSSA de Ploufragan en épidémiologie moléculaire ont réalisé quatre paires d’extraction sur des souches environnementales de L. monocytogenes.

La comparaison des signaux d’intensité entre deux expériences montre qu’il y a peu de différences entre les kits d’extraction. Cependant, cette expérience nous a montré l’importance de la concentration d’ADN, si l’extraction d’ADNg est insuffisante, les signaux se révèlent plus faible. Cette comparaison montre que la technique de puce à ADN peut s’adapter à différents types d’extraction d’ADNg.

Figure 21 : Rapport des intensités normalisées quiagen/wizard classés par ordre croissant lors de l’hybridation sur la puce de 2eme génération

La Figure 21 illustre deux paires d’hybridation avec les ADNg de souches n°987 et n°1710 provenant de l’AFSSA de Ploufragan. Dans le cas de la souche n°987, les extractions montrent peu de différences car les rapports ne sont pas supérieurs à un facteur 2 (à 4 exceptions près). En revanche, pour les souches n°1710, l’extraction d’ADNg avait été mal réalisé avec le kit Quiagen. Ceci explique que les intensités sont bien supérieures avec le kit Wizard par rapport au kit Quiagen.

2. Séparation des sérovars et division génomique

L’hybridation des souches de référence a permis de construire l’arbre de base de regroupement hiérarchique sur J-express. Les souches hybridées avec la puce 3 G forment des sous groupes qui corrèlent avec ceux formés par les anciennes puces. En effet, les espèces sont séparées et les diffèrent sérovars de L. monocytogenes sont regroupés entre eux. Les deux divisons génomiques illustré à la Figure 2 sont également présentes avec les sérovars 1/2b, 3b, 4b, 4d d’une part et les sérovars 1/2c, 1/2a, 3a et 3c d’autre part (Voir Annexe).

Pour tester la faculté de la puce 3 G à séparer les sérovars et à intégrer des nouvelles souches autre que les références dans la base de données, 4 souches provenant de Finlande (N° 3, 5, 9, 12) ont été hybridées. Auparavant, J’avais analysé les 20 souches responsables d’épidémie en Finlande par hybridation ADN/ADN sur la puce de 2eme génération. Le sérotype de ces souches (numérotées de 1 à 20) sont connues. De la même manière que la puce de 2eme génération, les quatre souches se sont regroupés avec les autres souches de leur sérovars respectifs : la n°3 et 5 avec les 1/2c, la n°9 avec les 1/2a et la n°12 avec les 1/2b.

Afin d’évaluer l’influence de l’apport de sondes provenant du génome de TIGR 1/2a, trois souches de L. monocytogenes de sérovars 1/2a isolé en France ont été hybridées. Les souches ont été regroupées avec les autres souches du sérovars 1/2a. La souche de portage L. monocytogenes CLIP93666 s’est regroupée avec la souche TIGR 1/2a tandis que les souches environnementales (CLIP93149 et CLIP93655) forme un autre sous groupe avec EGDe (Voir Figure 22).

Figure 22 : Formation du sous groupe de souches de sérovars 1/2a, 1/2c, 3a et 3c

3. Sous groupage de souches d’un même sérovars – analyse des souches du CDC

Le CDC d’Atlanta avait envoyé 11 souches au laboratoire numéroté de 1 a 11 pour une étude en aveugle. Ces souches correspondent à 2 épidémies (1 à 8 d’une part et 9 à 11 d’autre part). Les données épidémiologiques montraient que ces souches correspondaient à la même épidémie respectivement. Elles différaient pourtant très légèrement lors de l’analyse en PFGE. L’objectif de cette étude était de tester la valeur de typage des puces sur cette question particulière.

Avec la puce de 2eme génération, les souches, 9 et 10, forment un groupe de souches à part par rapport aux souches n°1 à 8. Les souches 1 et 2 sont très proches et ne différent que d’un phage. Les souches 6 et 8 sont très proche voire identique. La souche 5 ne diffère des souches 8 et 6 que par l’absence d’un phage. Cependant selon le CDC, la souche 5 est différente des souches 8 et 6. Les souches 3, 4 et 7 forment un groupe. La souche 3 diffère des souches 4 et 7 par la présence d’un phage. La souche 7 diffère des souches 3 et 4 par l’absence d’un autre phage.

Avec la nouvelle puce, le regroupement sur J-Express permet aussi de séparé les souches 9 et 10 des souches 1 à 8 (voir Figure 23).

Souches

Gènes

Figure 23 : Regroupement des souches 4b et des souches du CDC hybridées sur la puce 3 avec J-Express

Cependant avec J-Express la souche n°4 ne semble pas clustériser comme la puce de 2eme génération. En effet sur J-Express, elle clustérise avec la souches n°6.

Figure 24 : Regroupement des souches hybridées avec la puce 3G avec X-strain. Les dénominations des souches sont accompagnées de leurs sérovars

En revanche la simulation avec X-strain est plus conforme avec les observations réalisées avec la puce de 2eme génération. Selon le CDC, la souche 5 qui ne devait pas être aussi proche des souches 6 et 8 se retrouve dans les deux logiciels légèrement séparés. Comme précédemment les souches 9 et 10 clustérisent dans un autre sous-groupe. La souche 11 n’a pas été analysée avec la puce de deuxième génération.

Une analyse plus fine des résultats montre que la puce 3 G identifie mieux les différences entre ces souches. Cette amélioration de sensibilité est due à l’ajout des sondes phagiques et de sondes provenant de la souche TIGR 1/2a. Par ailleurs, les sondes qui ont été enlevées dans la puce 3 G comparé à la puce de 2eme génération n’ont pas d’impact sur la valeur discriminante de la puce.

IV. Discussions

A. Critique de la stratégie de sélection de gènes

La réalisation d’une puce in silico de 31 sondes a permis de partir sur une base minimum pour discriminer les espèces et les sérovars. La séparation et le regroupement des souches suivent bien le principe de lignage défini par l’analyse en champ pulsé. L’ajout progressif de sondes informatives permet d’améliorer le pouvoir discriminant au niveau de celui de la puce de 2eme génération avec un nombre de sondes divisé par 2,5. L’apport ensuite de nouveaux gènes absents de EGDe provenant d’une autre souche de sérovars 1/2a a permis par regroupement hiérarchique de former un sous groupe supplémentaire dans les souches de sérovars 1/2a. En reprenant l’exemple des souches du CDC, il se peut que l’intégration plus importante des gènes de phage ait permis une séparation plus nette de la souche n°5 par rapport aux souches n° 6 et 8. Cependant la constitution d’une base de données plus importante après hybridation d’un grand nombre de souches par le CNR Listeria devrait par la suite appuyer ce constat.

B. Influence du matériel

L’amplification PCR est l’étape cruciale pour la réalisation de la puce. Si la concentration intervient dans la qualité des taches, la qualité de l’amplification doit être bonne afin d’éviter la génération systématique de faux positif ou de faux négatif.

La température d’hybridation a également une influence sur les intensités des signaux. Une température de 65°C peut être une bonne solution pour constituer une base unique de L. monocytogenes phylogénétiquement proche avec un bruit de fond plus faible. En revanche, une température de 60°C est plus appropriée pour hybridées d’autre espèce comme L. innocua, ou même pour assurer une bonne hybridation des souches des 2 lignages de L. monocytogenes.

L’étude sur les différents lots de membrane a permis de montrer qu’ils influencent aussi la qualité des signaux. Le bruit de fond est variable mais on ne peut conclure sur la zone d’ambiguïté. Les membranes de nylon sont sans doute le matériel qui influence le moins l’intensité des signaux.

L’utilisation de la puce à ADN est flexible. En effet, elle peut s’adapter à plusieurs kits d’extraction. L’essentiel est que la concentration d’ADNg extraite soit suffisante pour le marquage sinon l’intensité des signaux est faible ainsi que la rapport signal/ bruit.

C. Fiabilité de la puce 3G

En séparant les espèces, les sérovars et en étant conforme avec les divisions génomiques, la puce 3G a montré sa fiabilité. Elle est au moins aussi discriminantes que la puce de 2eme génération. Cependant la constitution d’une base donnée de plusieurs centaines de souches pourrait conforter ce potentiel de discrimination.

La puce 3G permet d’intégrer dans sa base d’autres souches qui se regroupe avec leur sérovars respectif. En revanche pour les souches très proches phylogénétiquement, l’interprétation peut être différentes selon les logiciels utilisés. L’intégration de gènes de phage peut permettre de séparer au sein d’un sous groupe des souches très proche. C’est pour cette raison en partie que la souche n°5 du CDC a pu être séparée des souches 6 et 8.

D. Comparaison avec l’ancienne puce

Le nombre de sondes dans cette nouvelle puce a été réduit par un facteur deux avec 317 gènes sélectionnées. De plus, elle garde le même pouvoir discriminatoire que l’ancienne et se diversifie avec l’intégration de nouveaux gènes. A ce propos même si la proportion de sondes de EGDe reste très importante sur la puce, elle n’en demeure par moins représentatif puisque certaines sondes, comme lmo0066, sont contenues dans le génome de L. innocua et participe à la séparation des souches.

En comparant l’hybridation de EGDe entre la puce de 2eme génération et la puce 3G, la proportion de signaux ambiguës est réduite de prés de 58,7%. Cependant, il serait nécessaire d’hybrider plusieurs centaines de souches pour estimer plus significativement la baisse réelle de signaux ambigus.

Pour éviter le problème de cette étape de binarisation, l’utilisation de « X-strains » semble être un bon complément de J-express. En effet, cette méthode de classification corrèle bien avec J-Express et semble être encore plus juste pour les souches très proches comme celle du CDC.

Conclusion

Afin d’apprécier et de gérer le risque lié à une contamination à Listeria, la recherche scientifique a fait évoluer les méthodes de typages de plus en plus discriminantes. En entrant dans l’ère de la post-génomique, il est possible d’aller plus loin grâce à l’émergence des puces à ADN. Les puces à ADN permettent d’obtenir des informations fonctionnelles et d’analyser l’évolution de la diversité au sein d’une espèce.

Comme toute nouvelle méthode, le développement d’une puce à ADN pour le typage de Listéria a nécessité plusieurs mises au point. Celle-ci requiert un intérêt particulier aux valeurs ambiguës, source d’erreur dans la différenciation des souches. L’effort employé pour réduire les ambiguïtés a nécessité dans un premier temps une sélection discriminante de bonnes sondes mais aussi une étude importante sur l’influence de toutes les étapes de fabrication de la puce mais aussi lors de son utilisation.

Cette troisième génération de puce à ADN pour le typage de Listeria est au moins aussi discriminantes que les précédentes puces mais elle donne une part plus importante aux gènes de phage qui permettent de différencier les souches épidémiques très proches.

Le but final de cette puce est d’être intégré dans un processus de routine destiné au laboratoire de typage de Listéria. La réduction du nombre de gènes pourrait contribuer aussi à la réduction de sa taille physique afin de l’intégrer dans un appareil automatisable. Cependant, l’amélioration majeure serait d’utiliser un procédé de révélation autre que la radioactivité. Celle-ci ne pouvant pas être utilisé dans tous les laboratoires, il faudra réadapter son protocole d’utilisation. Une étude de faisabilité de l’utilisation de la chemiluminescence a donné des résultats très encourageant pour cette alternative non radioactive

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Tables des illustrations

Figure 1 : Protéine de surface liés par covalence avec la paroi cellulaire contenant un motif LPxTG.. 3

Figure 2 : Représentation des différentes lignées à partir d’un PFGE numérisé de 62 souches représentatives de L. monocytogenes ‎[2] 8

Figure 3 : Analyse d’acides nucléiques par puce à ADN.‎[13] 12

Figure 4 : Scan de la membrane portant 739 sondes en duplicata hybridée par l’ADNg de L. monocytogenes marquée radioactivement au ³³P 17

Figure 5 : Quantification des signaux avec Array-vision. 17

Figure 6 : Intensité brute classées par ordre croissant resultant de l'hybridation d'une souche de L. monocytogenes provenant de Helsinki 18

Figure 8 : Interface du logiciel J-Express. 21

Figure 9 : Interface du logiciel de pilotage « Gridding » du Qpix de Genetix. 29

Figure 10 : Organigramme décisionnel "if then else". 36

Figure 11 : Illustration de l'utilisation de la macro « subtest » dans la cas d'une recherche rapide de gènes lin dans le génome de EGDe 38

Figure 12 : Présentation des étapes de selection des gènes. 39

Figure 13 : Analyse en Composantes Principales d’une simulation « in silico », d’hybridation de 10 souches de référence avec les 31 sondes choisis dans la Figure 12. 40

Figure 15 : Photo sous UV d’un gel de migration en electrophorèse de 96 amplicons de gènes lmo. 44

Figure 16 : Intensités normalisées classées par ordre croissant Hybridation de la souches EGDe sur le prototype aux température de 60°C et 65°C.. 44

Figure 17 : Intensités normalisées situées dans le bruit de fond. 45

Figure 18 : Valeur ratio classé par ordre croissant 46

Figure 19 : Valeurs ratio situé dans le bruit de fond. 46

Figure 20 : Seuil de coupure et zone d’ambiguïté. 47

Figure 21 : Rapport des intensités normalisées quiagen/wizard classés par ordre croissant lors de l’hybridation sur la puce de 2eme génération. 48

Figure 22 : Formation du sous groupe de souches de sérovars 1/2a, 1/2c, 3a et 3c. 49

Figure 23 : Regroupement des souches 4b et des souches du CDC hybridées sur la puce 3 avec J-Express. 50

Figure 24 : Regroupement des souches hybridées avec la puce 3G avec X-strain. Les dénominations des souches sont accompagnées de leurs sérovars. 51

Tableau 1: Sérotypes au sein du genre Listeria. 6

Tableau 2 : Liste des difficultés rencontrées. 22

Tableau 3 : Souches matrices utilisées pour le développement de la nouvelle puce. 25

Tableau 4 : Descriptions des souches à hybrider sur le la puce 3G.. 26

Tableau 5 : Mélange réactionel pour la PCR et programme utilisé pour le thermocycleur (GeneAmp) 28

Tableau 6 : Paramètres de pilotage du Qpix pour le dépôt des sondes sur la macro-array. 30

Tableau 7 : Solution d’hybridation pour une membrane. 32

Tableau 8 : Macro sub test() applicable sur les logiciels Office Mac OS. 37

Tableau 9 : Nombre de gènes choisis en fonction de leur spécificité, de leur présence ou absence par rapport aux souches matrices. 42

Tableau 10 : Proportion de valeur ratio se situant dans la zone d'ambiguïté définit entre 0,2 et 0,4. 47

[1] Listeria n’est pas mobile à des températures supérieures à 30°C mais elle est sans doute mobile en dessous de 20°C

[3] TIGR : The Institut of Genomic Research - http://www.tigr.org/

[4] tache : (spots) terme utilisé pour designer un dépôt révélé.

[5] Gènes déposés (ou spottés) sur la membrane peuvent être appelées sondes

[6] TIGR : The Institut of Genomic Research - http://www.tigr.org/

[7] génolist pour Listéria: http://genolist.pasteur.fr/ListiList/index.html

[8] IPF : Individual Protein Files, ces fichiers, disponibles sur un serveur protégé, regroupent des informations sur le gène comme sa description, sa fonction, sa taille et la séquence protéique pour lequel il code.

[9] Primer 3 : http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

[11] L’échantillon d’ADNg à analyser est considéré comme étant toujours en excès.

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